Stosowane obecnie metody diagnostyczne opierają się na zastosowaniu różnych testów, dzięki którym można w krótkim czasie i w bezinwazyjny sposób wstępnie potwierdzić lub wykluczyć wiele chorób. Wykonanie testu ELISA pozwala szybko i skutecznie wykryć przeciwciała, które pojawiają się w organizmie na skutek kontaktu z określonym drobnoustrojem.
Test ELISA (enzyme linked immunosorbent assay, test immunoenzymatyczny) to jeden z najczęściej stosowanych testów. Wykonywany jest w celu określenia stężenia przeciwciał w badanym materiale biologicznym (np. krew, płyn mózgowo-rdzeniowy oraz inne płyny ustrojowe) i ma bardzo szerokie zastosowanie. Test ELISA pozwala wykryć w danej próbce obecność przeciwciał typowych dla schorzeń wywołanych przez bakterie, wirusy oraz pasożyty.
Test ELISA nie jest „wynalazkiem” ostatnich lat, został opracowany w latach 60. ubiegłego wieku. Powstał dzięki zaangażowaniu dwóch niezależnych zespołów badawczych. Dzięki niezależnie prowadzonym badaniom naukowym opracowano metodę diagnostyczną z zastosowaniem enzymów – wchodzą one w reakcje z antygenami, które charakteryzują się swoistymi przeciwciałami.
Testy ELISA znajdują obecnie zastosowanie nie tylko w diagnostyce medycznej, ale także m.in. w przemyśle spożywczym.
Co to jest test ELISA?
Test ELISA to test immunoenzymatyczny, który znajduje zastosowanie np. w badaniach biomedycznych. Dzięki niemu możliwe jest wykrycie określonych, specyficznych białek w pobranym materiale biologicznym. Niegdyś test ELISA stosowany był jedynie w celu badania surowicy pacjenta. Obecnie tą metodą badany jest także inny materiał biologiczny. Test wykrywa zawartość białka przy użyciu przeciwciał poliklonalnych lub monoklonalnych skoniugowanych z odpowiednim enzymem.
Dzięki testowi ELISA mogą zostać wykryte zakażenia, które zostały wywołane m.in. wirusem HIV, gronkowcem złocistym, pałeczkami H. pylori, wirusami zapalenia wątroby, bakteriami E. coli, rotawirusami, bakteriami Yersinia, niektórymi wirusami grypy, krętkami Borrelia. Test ELISA bywa również stosowany na etapie diagnostyki chorób autoimmunologicznych np. reumatoidalnego zapalenia stawów (RZS). Test ELISA jest obecnie jednym z najważniejszych testów stosowanych w diagnostyce boreliozy.
Można go wykonać bardzo szybko i niewielkim kosztem – badanie jest znacznie tańsze niż np. test genetyczny, który wykrywa te same przeciwciała IgM i IgG. Test ELISA i inne testy immunologiczne mają zwykle formę płytek – wykonywany jest na 96-dołkowych płytkach polistyrenowych.
Warto podkreślić, że zaletą testu ELISA jest to, że jest stosunkowo tani. Tym samym biorąc pod uwagę skuteczność badania, nie dziwi tak duża jego popularność.
Na czym polega test ELISA?
Ogólna zasada wykonywania testu ELISA uwzględnia trzy etapy.
Pierwszy etap testu ELISA uwzględnia opłaszczanie 96-dołkowej płytki antygenem lub przeciwciałem.
Drugi etap testu ELISA uwzględnia blokowanie wolnych miejsc za pomocą roztworu owoalbuminy lub odtłuszczonego mleka w celu zapobiegania nieselektywnemu wiązaniu białek do fazy stałej.
Trzeci etap testu ELISA uwzględnia łączenie antygenu ze specyficznym przeciwciałem. Reakcja antygen-przeciwciało możliwa jest dzięki odpowiednio dobranym enzymom i jest to reakcja barwna. Najczęściej stosowane podczas wykonywania testu ELISA enzymy to fosfataza alkaliczna, peroksydaza chrzanowa oraz oksydaza glukozowa. Zmiana barwy roztworu odczytywana jest w spektofotometrze w oparciu o krzywą kalibracyjną. W celu przygotowania krzywej kalibracyjnej przygotowuje się roztwory o różnych stężeniach.
Test ELISA wykonywany jest w czterech wariantach.
Warianty testu ELISA
Wyróżniamy cztery warianty testu ELISA, czyli:
- test ELISA bezpośredni,
- test ELISA pośredni,
- test ELISA podwójnego wiązania (test kanapkowy, sandwich ELISA),
- kompetycyjny test ELISA (test rywalizacyjny).
Aby wykonać test bezpośredni, do płytki opłaszczonej antygenem trzeba dodać specyficzne dla antygenu przeciwciała znakowane odpowiednio enzymem, dzięki którym przeprowadza się inkubację. Przeciwciała specyficznie łączą się z antygenem, a przeciwciała niezwiązane są wymywane. Po dodaniu roztworu substrat/chromofor, enzym katalizuje reakcję i powstaje barwny produkt reakcji, który jest odczytywany. Test bezpośredni to najprostszy i najszybszy wariant testu ELISA.
Aby wykonać test pośredni, do płytki opłaszczonej antygenem trzeba dodać przeciwciała pierwszorzędowe, które podczas inkubacji w badanej próbce wiążą się specyficznie z antygenem. Przeciwciała niezwiązane są wymywane. Kolejnym krokiem jest dodanie przeciwciał drugorzędowych, które są znakowane enzymem. Łączą się one z przeciwciałem pierwszorzędowym na zasadzie rozpoznania izotypu. Nadmiar przeciwciał zostaje wymyty. Substrat/chromofor jest dodawany na płytkę, a enzym katalizuje reakcję. Powstaje barwny produkt reakcji, który odczytywany jest spektrofotometrycznie. Test pośredni wymaga więcej pracy i czasu niż test bezpośredni.
Aby wykonać test podwójnego wiązania, czyli test ELISA kanapkowy (sandwich ELISA), do płytki opłaszczonej antygenem trzeba dodać antygen, który jest rozpoznawany przez związane na powierzchni płytki przeciwciała. Kolejnym krokiem jest dodanie przeciwciał pierwszorzędowych, które również łączą się z antygenem. Następnie trzeba wypłukać nadmiar przeciwciał pierwszorzędowych i dodać przeciwciała drugorzędowe, wyznakowane enzymem. Następnie, roztwór substrat/chromofor jest dodawany na płytkę, a enzym katalizuje reakcję. Powstaje barwny produkt reakcji, który odczytywany jest spektrofotometrycznie.
Aby wykonać test kompetycyjny (test ELISA rywalizacyjny), do płytki opłaszczonej antygenem trzeba dodać surowicę oraz specyficzne wobec antygenu przeciwciało wyznakowane enzymem. Nastąpi wtedy współzawodnictwo pomiędzy przeciwciałami pochodzącymi z surowicy a przeciwciałami wyznakowanymi. W ten sposób określa się ilość przeciwciał w surowicy krwi. Silna reakcja barwna oznacza, że z antygenem połączyło się dużo przeciwciał wyznakowanych.
Czytaj też:
Polacy boją się tych chorób jak ognia. Mimo to lekceważą objawy i unikają badań profilaktycznychCzytaj też:
Ile kosztują podstawowe badania moczu prywatnie? Poznaj aktualny cennik
Źródła:
- Binduga I., Gut W., Jarząbek Z., Ocena przydatności metody ELISA do oznaczania poziomu przeciwciał dla enterowirusów w surowicy i płynie mózgowo-rdzeniowym, Medycyna Doświadczalna i Mikrobiologia, tom 50, 3-4/1998, s. 277-284
- Smoleńska Ż, Matyjasek A., Zdrojewski Z., Borelioza – najnowsze rekomendacje w diagnostyce i leczeniu, Rheumatology Forum, tom 2, 2/2016