Zastępca dyrektora ds. bezpieczeństwa epidemiologicznego i środowiskowego Narodowego Instytutu Zdrowia Publicznego-Państwowego Zakładu Higieny zaznaczył w rozmowie z PAP, że w diagnostyce wyniki badań zależą w dużej mierze od materiału pobranego do analizy. Na razie u pacjentów z podejrzeniem zakażenia koronawirusem pobiera się próbkę i wykonuje test molekularny. Laboratorium podaje pierwszy wyniki w ciągu 24-48 godzin, jeśli nie wykryto obecności wirusa pobiera się kolejną próbkę i powtarza badanie.
PAP: Jak wygląda diagnostyka pacjentów z podejrzeniem zakażenia koronawirusem? Na czym polega badanie? Jaki materiał poddaje się analizie w laboratorium?
Rafał Gierczyński: Materiał badań jest adekwatny do stanu klinicznego pacjenta, a jego rodzaj wpływa na uzyskane wyniki analityczne. Dlatego u osób, które nie mają objawów choroby, materiał, który najczęściej dostajemy, to wymaz z nosogardzieli. Trzeba jednak zaznaczyć, że taki materiał bywa trudny do wykrycia wirusa, bo w górnych drogach oddechowych mamy bogatą florę mikroorganizmów. Natomiast pewnym materiałem do badań jest ten pobrany z dolnych dróg oddechowych tzw. bronchaspirat i popłuczyny pęcherzykowo-oskrzelowe (BAL). Jednak taki materiał pobiera się u osób w złym stanie klinicznym.
Czyli nie u pacjentów, którzy powrócili z Wuhan w niedzielę i trafili na obserwację do szpitala we Wrocławiu? U nich żadne niepokojące objawy nie występowały?
W badaniach, z którymi teraz mieliśmy do czynienia, materiał pochodził z wymazu z nosogardzieli, bo jak wspomniałem, to był ten przypadek, gdzie stan badanych osób nie wskazywał na chorobę.
A jak wygląda diagnostyka krok po kroku?
Jeśli zaś chodzi o to, jak technicznie wygląda badanie, to próbkę otrzymujemy z opisem. Jest ona przesyłana do nas transportem medycznym z oddziału zakaźnego. To są pudełka szczelnie zamknięte, kilkuwarstwowe. Podkreślam też, że w laboratorium wykonujemy wyłącznie badania, o których zleceniu poinformowana została Państwowa Inspekcja Sanitarna. Zaznaczę tylko, że nie przyjmujemy badań od osób prywatnych, klinik, szpitali bez uzgodnienia z sanepidem. Wyjątek stanowią pacjenci szpitali zakaźnych i oddziałów zakaźnych. Wracając jednak do głównego wątku dodam, że próbka następnie trafia do laboratorium zapewniającego trzeci stopnień hermetyczności (BSL-3), które mamy w instytucie. Tutaj pracują trzy osoby – operator, pomocnik operatora i obserwator. Są oni zabezpieczeni, tak jakby pracowali z dżumą, wirusem Eboli, wąglikiem. To nasza standardowa procedura. Po otwarciu próbek zaczyna się procedurę izolacji kwasu nukleinowego wirusa, w tym przypadku jest to RNA. Na samym początku dochodzi do inaktywacji wirusa, czyli dodajemy odczynniki, by fizycznie zniszczyć samego wirusa, ale pozostawić jego kwas nukleinowy. W tym momencie wirus nie jest kompletny i nie ma już skuteczności zakaźnej. Dalsze etapy badania są już wykonywane w laboratorium BSL-2, z podwyższoną ochroną osobistą. To jest czasochłonny proces.
Ile taki proces w takim razie trwa od momentu, gdy dochodzi do rozpakowania materiału i wyizolowania RNA?
Średnio czas pracy w laboratorium BSL-3 wynosi trzy godziny ze względu na trudne warunki pracy. Cały czas w pomieszczeniu utrzymywane jest podciśnienie, powietrze podlega częstej wymianie i oczyszczaniu przez filtry HEPA, co powoduje wysychanie skóry i suchość w gardle, a ze względu na kombinezony ochronne, gogle, maski oddechowe odczuwa się gorąco, skóra się poci i szybko wysycha, co powoduje szybką utratę płynów i odczucie pragnienia. Pracujące w takich warunkach osoby szybko stają się bardzo zmęczone. Dlatego w BSL-3 nie pracuje się dłużej niż trzy godziny, a maksymalnie cztery godziny pracują jedynie bardzo doświadczeni pracownicy o wzorowej kondycji psychofizycznej i odporności na stres wynikły ze świadomości, że trzymają w rękach bardzo niebezpieczny materiał biologiczny. Do wspomnianych trzech godzin trzeba dodać po 40 min. na ubranie się przed wejściem i procedurę zdjęcia kombinezonów przy wychodzeniu z BSL-3.
Potem, jak już pan wspomniał, trafia on do laboratorium BSL-2.
Tak. Wyizolowany kwas nukleinowy wirusa trafia właśnie tam. W tym laboratorium prowadzona jest dalsza izolacja. Następnie wyizolowany materiał przekazuje się do badań molekularnych. W tej chwili używamy dwóch różnych metod. Pierwsza to reakcja PCR z użyciem odwrotnej transkryptazy, druga metoda polega na tym samym, ale używa się przy niej termocyklerów w odczytujących wynik w czasie rzeczywistym tzw. real-time PCR przy użyciu specjalnej sondy DNA. Każda z tych metod ma swoje zalety i jest nakierowana na różne fragmenty genomu wirusa. Metoda real-time podaje wynik szybko i jest bardzo czuła tzn. potrafimy wykryć niewielką zawartość wirusa, ale też istnieje tutaj ryzyko osiągnięcia wyników fałszywie dodatnich – właśnie z powodu tak wysokiej czułości.
Czytaj też:
Ponownie zbadali Polaków, którzy wrócili z Wuhan. Ministerstwo podało wyniki
Dlaczego należy powtórzyć badanie?
Wiemy, że najdłuższy okres inkubacji, jaki stwierdzono u chorego, to 14 dni. Z tego względu konieczne jest cykliczne badanie osób, które nie mają objawów, a wiemy, że mogły ulec zakażeniu, bo były w tym miejscu, gdzie wirus krąży. Dlatego też pobieramy w interwałach kolejne próbki, by sprawdzić, czy wirus czasem nie osiągnął u tej osoby poziomu wykrywalności. O kolejnych badaniach decyduje jednak lekarz. Prawda jest taka, że skoro wiemy, że inkubacja wynosi do 14 dni, to jeśli w tym czasie pacjent nie będzie miał żadnych objawów chorobowych, to uznajemy, że nie jest zakażony. Na tym etapie jednak, w jakim jesteśmy, obserwujemy wszystkich, którzy byli w strefie zagrożenia.
Co już wiemy o wirusie z Wuhan? Jak jest zbudowany?
Ma około 30 tys. par zasad, czyli jednostek kodu genetycznego, z których zbudowany jest RNA, czyli znanych nam z lekcji biologii literek A, U, G, C. Wirus posiada potencjalnych 12 jednostek translacyjnych, geny strukturalne i niestrukturalne. W naszych badaniach akurat celujemy w jeden z najstabilniejszych odcinków tego wirusa, czyli w gen nukleokapsydu (N) oraz w gen otoczki (E). Dzięki postępowi nauki możemy obecnie szybko sekwencjonować kwasy nukleinowe, czyli określić pełen kod genetyczny wirusa, nawet bez uprzedniego wyizolowania wirusa. Upraszczając możemy powiedzieć, że możemy te wszystkie 30 tys. literek określić zanim uda nam się wirusa wyhodować. Izolacja wirusa, czyli namnożenie go w linii komórkowej poza ustrojem człowieka, udała się już Australijczykom i Włochom.
Jeśli chodzi o samą charakterystykę wirusa z Wuhan, to jest to betakoronawirus z linii rozwojowej B, w której znajduje się też wirus SARS, który kilkanaście lat temu wywołał groźną epidemię i spowodował zgon blisko 800 osób. Do niego wirus z Wuhan jest podobny pod względem budowy. Obecnie naukowcy uważają, że może on być pochodną odmiany wirusa SARS występującej u nietoperzy, choć to wciąż wstępna faza badań.
Można powiedzieć, że sporo już o tym wirusie wiemy, biorąc pod uwagę fakt, że pierwszy potwierdzony przypadek zachorowania mieliśmy na początku grudnia 2019 roku.
Mając na uwadze, że od pierwszego zachorowania upłynęły zaledwie dwa miesiące, to trzeba uznać, że tempo szerzenia się wirusa, ale też postępu wiedzy o jego epidemiologii i technologii wykrywania jest bardzo duże. Myślę, że jako społeczność światowa jesteśmy przygotowani na możliwość szybkiej identyfikacji osób zakażonych i ograniczania szerzenia się zachorowań, a potem opracowania szczepionki albo znalezienia leku.
Jak walczyć z wirusem?
Na razie największym orężem jest izolacja osób chorych i niedopuszczenie do fizycznego szerzenia się wirusa.
Rozmawiała Klaudia Torchała (PAP)